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技术讲堂—抗体的选择(2)

发布日期: 2019-09-27
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一•●、一抗选择需要确定或参考的信息

(一)目的蛋白的信息

确定想检测的目的蛋白是否与抗体识别蛋白信息吻合,注意中英文名字•●、别名等信息。

某些蛋白具有多种不同的亚型,这需要在选择抗体之前确定要研究的蛋白亚型。还有些抗体由于其抗原选择的是不同蛋白亚型共有的肽段区域,是可以同时识别多个亚型的。有的蛋白通过剪切加工才能转变为成熟的活性形式,如Caspase•●、Insulin等,这就需要根据研究需要,选择针对前体或成熟形式的特异性抗体。

(二)抗体制备所用抗原的信息

抗体是由各种不同抗原免疫宿主而制备得来,抗原类型包括:全长蛋白•●、蛋白片段•●、多肽•●、全有机体(如:细菌)或细胞,抗体说明书一般都有制备抗体所用抗原的描述。在有些情况下,需要查阅抗体制备相关抗原信息来选择抗体。比如,针对重组表达蛋白选择抗体,如果是表达部分蛋白片段,则需要注意抗体的抗原区域是否在该片段区域内。某些特殊蛋白(如病原体蛋白)未经过内部验证种属的目的蛋白,需要求助生产商进行蛋白同源性序列比对,并结合制备抗体所用的抗原序列,查看交叉反应的情况。

(三)修饰位点的信息

在选择合适的抗体用于特定修饰位点研究时,需要特别注意,不同位点的修饰可能有不同的机制存在,不宜一概而论。有关不同修饰位点的功能,可以通过查阅文献确定。另外,由于有的蛋白存在不同亚型且序列高度同源,而不同亚型的某些磷酸化修饰位点周围的序列完全相同,因此针对这些保守的修饰位点的抗体往往会同时识别不同亚型的相似修饰位点。

(四)实验样本的种属信息

抗体一般会在出厂前对常见的不同种属目标样本进行内部验证,以确定可以满足的不同种属类型,可以在产品说明书的Species-Reactivity一栏中看到(如人•●、小鼠•●、大鼠等)。通过验证,达到质检要求的种属会明确标记,以备参考。没有做过关于这些种属的实验,所以不建议使用。一些没有标明的种属,也有可能是可以应用的,建议通过联系抗体公司技术支持来获得相关抗原序列比对的信息,根据蛋白同源性的情况以确定是否可以用于该种属的样本。为了避免实验风险,尽量不要使用说明书中没有提及的标本的种属的抗体。

(五)抗体应用的实验类型

抗体一般会在出厂前对常见的抗体应用(WB•●、IP•●、ChIP•●、IHC•●、IF•●、FCM)进行内部验证,以确定是否可以满足不同应用要求。通过验证,达到质检要求的抗体会明确标记,以备参考。一些没有标明的应用,往往是因为经过验证没有达到质检标准而不推荐,千万不要根据经验或常识去推测某个抗体的应用。比如,有的客户会认为,既然某个抗体可以用于IHC,根据经验推断应该可以用于IF,但毕竟这是不同的两个应用,这样做可能会浪费很多时间和试剂而不能获得结果?固宄Ъ也煌萍瞿褂妹挥斜昝鞯挠τ,可以挑选其他的货号,可能有适用于这个应用的更好的其它产品。如果抗体说明书没有提及的应用类型,并不意味着该抗体不适用于此种应用类型,而仅是说明尚未经过此种应用的内部验证。为了避免实验风险,当说明书中没有提及的应用方法时,可向生产商申请试用装,进行初步预实验后,再决定是否购买。

(六)标记物的信息

有一些实验,如多重免疫荧光•●、多指标流式测定可能会使用到直接标记的一抗(简称直标一抗)。在进行直标一抗选择时,需要了解到自己将要使用的仪器能检测到的荧光范围,针对不同的参数要求选择合适的标记物。在设计多重实验时,应考虑每种荧光基团的独特性质,如最大吸收波长和最大发射波长,消光系数和斯托克斯位移等因素。有关标记物选择的细节,我们将在后面的免疫荧光与流式技术部分详加介绍。

 

二抗选择需要确定或参考的信息

(一)一抗的来源种属

主要根据一抗来源种属而决定二抗来源,如一抗是小鼠来源,那二抗就买抗小鼠的即可。

(二)二抗应用的实验类型

针对不同的实验应用,需要考虑二抗所偶联的标记物,如HRP•●、Biotin•●、荧光素等标记物。WB与IHC所用的二抗,所带的标记物主要选择HRP和Biotin,而免疫荧光和流式应用可根据实验设计的需要,选择不同荧光素标记的二抗,如FITC•●、Cy3•●、PE等。

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