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介绍下有关于酶联免疫试剂盒的操作步骤

发布日期: 2019-04-17
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   酶联免疫试剂盒是酶免疫测定技术中应用较广的技术。其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用ELISA酶联免疫吸附试验,法有双抗体夹心法和间接法,前者用于检测大分子抗原,后者用于测定特异抗体。

        基本原理酶联免疫试剂盒方法的基本原理是酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合,此种结合不会改变抗体的免疫学特性,也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后,底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型,出现颜色反应。因此,可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应,颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过酶联免疫试剂盒检测仪进行定量测定,这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来,使酶联免疫试剂盒方法成为一种既特异又敏感的检测方法。
 
  酶联免疫试剂盒操作步骤
 
  1.确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目。
 
  2.将倍比稀释的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中,1孔只加样品稀释液的作为对照。处理后的标本按100ul每孔加入。
 
  3.酶标板加上盖,37℃反应90分钟。
 
  4.反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体;或甩去酶标板内液体,再对着吸水纸拍几下。洗涤2次。
 
  5.将准备好的生物素抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应60分钟。
 
  6.0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次,每次浸泡1分钟左右。
 
  7.将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入。37℃反应30分钟。
 
  8.0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次,每次浸泡1-2分钟左右。
 
  9.按每孔0.1ml依次加入TMB显色工作液,37℃避光反应,反应过程中,要经常的观察,当肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔差别不明显时,即可加入TMB终止液0.1ml/孔。(显色反应不要超过30分钟)。
 
  10.用酶标仪在450nm测定O.D.值。
 
  11.根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍,其实际浓度应该×N。
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